Mẫu chốt giải phổ NMR

Giải phổ thường được xem là mục đích và quan trọng nhất với những người tìm đến quán NMRHanoi. Điều này thể hiện rõ khi khảo sát thống kê số người đọc các trang của NMRHanoi: "#8. Giải phổ NMR" luôn là trang nằm trong top 5 trang được nhiều khách thăm nhất.

Lư ý rằng: Bản thân NMR luôn đổi mới hàng năm với nhiều kỹ thuật mới, dạng phổ mới ra đời, lại được hỗ trợ liên tục bằng các kỹ thuật xử lý dữ liệu, phần mềm, ... thời 4.0 nên Giải phổ cũng luôn đổi mới. Cách giải phổ của hôm nay là đúng, đến ngày mai vẫn không sai, vẫn dùng được, nhưng có thể sẽ trở nên lạc hậu, cũng như thư dán tem vẫn được dùng, nhưng thư @ sẽ ngày càng trở nên tiện lợi, kinh tế và phổ biến hơn.

Bạn đọc có thể tìm xem các video clip giới thiệu và cập nhật các công cụ trợ giúp giải phổ và giải phổ tự động trên Youtube, với từ khóa "NMRHanoi".

Với NMRHanoi, giải phổ cũng sẽ là phần viết mất nhiều công sức nhất và có thể nói sẽ là trang không bao giờ viết xong, rất cần sự cộng tác, cập nhật của các đồng nghiệp NMR. Vì khối lượng nội dung đồ sộ của trang Giải phổ NMR nên nó được chia nhỏ thành nhiều trang con theo chuyên đề, theo đối tượng chất để dễ viết, dễ đọc. Bố cục tạm thời của phần Giải phổ là như sau:

1. Các khái niệm chung về giải phổ, định hướng, quy tắc, chuẩn dữ liệu, phân lớp chất và phổ (#8 - Trang này).
2. Các ví dụ giải phổ từ đơn giản đến phức tạp (#8A đến #8D)- Chủ yếu dành cho người mới làm quen với Giải phổ ở các mức độ cao thấp khác nhau.
3. Đặc điểm cấu trúc và phổ NMR của các lớp hợp chất hữu cơ cơ bản (#8E đến #8K)
4. Các công cụ phần mềm và cơ sở dữ liệu trợ giúp giải phổ (#8L)

8.1 Chiến lược giải phổ NMR

8.1.1. Con đường từ phổ NMR đến cấu trúc

"Từ Phổ NMR đến Cấu trúc" là chặng đường cuối cùng của con đường dài gian nan vất vả "Từ mẫu đến Cấu trúc" và cũng là chặng đường có tính "hên xui" nhiều nhất. Trước đó là chặng đường "Từ Mẫu đến Phổ", bao gồm cả mẫu tự nhiên, chiết tách và mẫu tổng hợp, bán tổng hợp. Có thể chỉ đơn giản vài bước chân là đi hết đoạn cuối đầy háo hức này, nhưng cũng có thể phải lận đận vài ngày, vài tuần, có khi cả tháng mất ăn, mất ngủ mới đến được cột đích "Cấu trúc", thậm chí có khi không bao giờ đến được đích! Điều đó phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó có cả các yếu tố chủ quan và yếu tố khách quan như sẽ được tóm tắt dưới đây:

1. Mức độ phức tạp về cấu trúc của phân tử cần phân tích. Với các phân tử nhỏ, ví dụ Chloroform, Ethylbenzene, .. chúng ta chỉ cần duy nhất 01 phổ proton và nhìn lướt qua là chốt được cấu trúc, nhưng với các protein, dù là protein nhỏ, thì thời gian trung bình để xác định cấu trúc cũng phải từ 2 đến 3 tháng, thậm chí mất nửa năm dù đã đo đủ các loại phổ với chi phí trung bình 50.000 - 80.000$/01 cấu trúc protein.
2. Mức độ đầy đủ của bộ dữ liệu phổ, trước nhất là phổ NMR. Với phân tử đơn giản hay phân tử quen thuộc, có thể chỉ cần phổ 1H NMR hoặc thêm phổ 13C NMR là đủ, nhưng với các cấu trúc phức tạp, chúng ta thường phải cần có thêm các dạng phổ 1 chiều (1D NMR), 2 chiều (2D NMR), phổ đồng nhân (COSY, TOCSY, NOESY, ...), phổ dị nhân (HSQC, HMBC, ...), kể cả các loại phổ không phải NMR, như sắc ký (GC, LC), phổ khối (MS), hồng ngoại (IR) để hỗ trơ. Đôi khi, bộ phổ NMR còn gồm một dạng phổ nhưng đo trong các dung môi khác nhau, đo ở các nhiệt độ khác nhau, đo với các tham số, chế độ đo khác nhau để nhận được các thông tin bổ sung về cấu trúc.
3. Mức độ chính xác và tin tưởng của dữ liệu phổ NMR. Điều này phụ thuộc tay nghề và kinh nghiệm người chuẩn bị mẫu (độ sạch của mẫu, chọn dung môi, ... ), của người đo và xử lý phổ NMR, chất lượng máy phổ NMR (tần số 200, 500 hay 700 MHz). Lý tưởng là có mẫu sạch, hòa tan tốt và bộ phổ NMR có độ nhạy và độ phân giải tốt nhất, căn phổ (calibrate) chuẩn nhất, hạn chế tối đa nhiễu (noises) và các tín hiệu ảo (artifacts). 
4. Trình độ, kiến thức và kinh nghiệm của những người phân tích phổ, có thể theo bài bản, có thể theo kinh nghiệm.
5. Công cụ hỗ trợ giải phổ, nhất là với các phân tử phức tạp, bao gồm các cơ sở dữ liệu, phần mềm mô phỏng, phần mềm dự đoán cấu trúc, dự đoán phổ.

8.1.2. Các bài toán NMR cơ bản

Bài toán xác định cấu trúc phân tử tương đối đa dạng, với những yêu cầu và mục đích khác nhau. Dù vậy có thể quy việc phân tích phổ NMR thành các "Bài toán NMR" hay "Nhiệm vụ NMR" cơ bản như sau:

1. Bài toán 1: Đồng nhất các đặc trưng của phổ hay bộ phổ thực nghiệm NMR đo được với công thức cấu trúc hay tên chất dự đoán hoặc biết trước. Việc này thường được gọi là "gán phổ". Có thể ví nhiệm vụ gán phổ NMR là giải toán khi đã biết trước đáp số hay còn gọi là Bài toán chứng minh: Chứng minh phổ hay bộ phổ thực nghiệm NMR đo được chính là phổ của cấu trúc A hay B đã biết.
2. Bài toán 2: Xác định công thức cấu trúc của một chất dựa trên dữ liệu phổ NMR hay thường gọi là "Xác định chất chưa biết dựa trên phổ NMR". Có thể ví nhiệm vụ này là giải bài toán để tìm đáp số chưa biết.
3. Bài toán 3: Định lượng NMR (qNMR), nhằm xác đinh nồng độ đơn chất trong hỗn hợp, xác định độ sạch của hợp chất. Ví dụ xác định nồng độ chất A trong sản phẩm dược hay nồng độ chất B trong thực phẩm, so sánh nồng độ chất C trong các lô sản phẩm khác nhau, xác định độ sạch chất chuẩn cho HPLC. QNMR thường được thực hiện trên phổ 1H NMR, là phổ có tính định lượng cao hơn so với phổ 13C NMR.  
4. Bài toán 4: Phân tích NMR mẫu hỗn hợp hay còn gọi là thống kê NMR. Đây là xu hướng mới trong nghiên cứu NMR kết hợp với thống kê đa biến với tên gọi là Nghiên cứu chuyển hóa chất dựa trên phổ NMR (NMR based Metabolomics). 
5. Bài toán 5: Nghiên cứu đặc trưng động học của phân tử hay các nguyên tử trong phân tử hay còn gọi là NMR động học, như nghiên cứu hiện tượng Tautomer, nghiên cứu thời gian hồi phục từ của các vị trí nhất định trong phân tử.

Trên thực tế, bài toán gán phổ NMR (Bài toán 1) thường chiếm tỷ lệ cao nhất so với các bài toán NMR khác. Ở Việt Nam, nơi NMR còn "non trẻ" và chưa thực sự phát triển mạnh, hầu như các phân tích NMR đều thuộc bài toán 1 và 2, trong đó bài toán 1 chiếm tỷ lệ áp đảo.

Số liệu thống kê từ cơ sở dữ liệu NMR của Trung tâm Phổ ứng dụng - Viện Hóa học, từ năm 2001 đến 2016.

8.1.3. Quy trình và quy tắc giải phổ NMR

Như trên đã nói, hiện tại nhiệm vụ "Phân tích phổ", hay như trong tiếng Việt thường gọi là "Giải phổ", ở Việt Nam hầu như chủ yếu là bài toán 1 và bài toán 2 trong số 5 bài toán NMR điển hình nêu trên. Quy trình giải phổ thông thường và tổng quát cho cả 2 bài toán này gồm các bước sau:

• Bước 1: Xác định công thức phân tử của chất cần nghiên cứu dựa trên dữ liệu phổ khối. 
• Bước 2: Xác định số nối đôi của chất cần nghiên cứu dựa trên công thức phân tử.
• Bước 3: Nhận biết một số nhóm chức dựa trên dữ liệu FTIR. 
• Bước 4: Gán các tín hiệu NMR trên phổ cho các nguyên tử hay nhóm chức dựa trên các đặc trưng phổ.
• Bước 5: Sàng lọc, sắp xếp các nguyên tử, các nhóm chức một cách hợp lý thành cấu trúc không gian của phân tử.
• Bước 6: Kiểm tra lại công thức cấu trúc.

Lưu ý: 

1. Tùy bài toán cụ thể mà một hay vài bước trong quy trình trên có thể được bỏ qua. Ví dụ, với Bài toán 1 (chứng minh cấu trúc, khẳng định cấu trúc hay gán cấu trúc), bước xác định công thức phân tử (bước 1), thậm chí bước xác định công thức cấu trúc (bước 5) đã được cho trước nên không phải thực hiện. 
2. Quá trình giải phổ không phải lúc nào cũng rành rẽ, thực hiện cuốn chiếu, xong bước 1 sẽ sang bước 2 rồi sang bước 3, bước 4, ... Ví dụ, để xác định công thức phân tử, nếu với dữ liệu MS nguyên (nominal mass) hoặc dữ liệu MS có độ chính xác không đủ cao sẽ cho ra nhiều công thức. Khi đó, đòi hỏi phải thực hiện tiếp một phần các bước 2-3-4 mới quay lại hoàn thành bước 1.

Có nhiều quy tắc trong giải phổ NMR, bao gồm các quy tắc vàng, các quy tắc chung, các quy tắc cho những trường hợp riêng biệt và một số thủ thuật. Một số quy tắc và thủ thuật giải phổ được NMR Hanoi sưu tầm và liệt kê dưới đây:

• Dữ liệu phổ thực nghiệm ít (đo ít loại phổ) thì thời gian giải phổ sẽ dài, dù vậy với các phân tử đơn giản, nhiều khi chỉ cần phổ 1H NMR là đủ, không cần đo các dạng phổ khác để tiết kiệm kinh phí, trừ khi có yêu cầu bắt buộc (luận án, bài báo yêu cầu đủ dạng phổ).
• Với các cấu trúc tương đối phức tạp và phức tạp, nên lập bảng phân tích dữ liệu NMR để bao quát dữ liệu và quá trình giải phổ.
• Cấu trúc phân tử là một bức hình với các khối, các mảnh được bố cục cực kỳ chính xác và chặt chẽ, khi xếp đúng thì im phăng phắc, xếp sai dù chỉ một ly là bức hình sẽ bung biêng, sẵn sàng rơi đổ lả tả. Do vậy kết quả giải phổ chỉ có thể là hoàn toàn "Đúng 100%" hoặc hoàn toàn "Sai" (0%), chứ không có kết quả gần đúng (87% hay 95%), giống như trong trò chơi ghép hình (Puzzle Game).
• Không nên quá kỳ vọng vào các công cụ phần mềm dự đoán, giải phổ. Chúng chỉ có vai trò hỗ trợ, gợi ý.

Một số ví dụ minh họa các bài toán giải phổ điển hình từ mức thấp nhất (bậc tiểu học - 11A), các mức trung bình (Trung học phổ thông - 11B), trên trung bình (trung học phổ thông - 11C) cho đến mức tương đối khó (bậc đại học 11D) được trình bày ở các trang tiếp theo. Tất nhiên, ở đây phải hiểu "bậc" là "bậc NMR", không phải "tiểu học NMR" nghĩa là dành cho lứa tuổi hồng 7-9 tuổi.

8.1.4 Định dạng và chuẩn công bố dữ liệu NMR

Dữ liệu NMR khá phức tạp, bao gồm thông tin về độ dịch chuyển hóa học, hằng số tương tác J, vạch bội, loại dung môi, tần số máy NMR. Cách mô tả, thứ tự sắp xếp, định dạng, ký hiệu các thông tin trên chưa được nhất trí cho mọi tạp chí, nhà xuất bản. Do vậy, hiện tại, dữ liệu NMR công bố trên tạp chí nào, nhà xuất bản nào vẫn phải theo chuẩn của tạp chí hay nhà xuất bản đó.

Dưới đây là chuẩn công bố dữ liệu NMR của 07 tạp chí quốc tế thường công bố dữ liệu NMR. Ví dụ minh họa với dữ liệu phổ 1H và 13C của mẫu Alpha Ionone, đo trên máy NMR 400MHz, dung môi CDCl3.

Cấu trúc hóa học của Alpha Ionone

Ví dụ chuẩn công bố dữ liệu NMR (1H và 13C) của Alpha Ionone trên 7 tạp chí quốc tế.

Hiện tại NMRHanoi chưa có trong tay chuẩn công bố dữ liệu NMR của các tạp chí Việt Nam, nơi thường công bố các kết quả NMR. Bạn nào biết hoặc có, làm ơn gửi lên NMRHanoi để cộng đồng NMR cùng chia sẻ.

8.2. Phổ NMR một số lớp chất hữu cơ điển hình (đang viết)

8.2.1. Tổng quan về phân loại các hợp chất hữu cơ 

Các hợp chất hữu cơ rất phong phú, nên việc phân loại chúng cũng rất phức tạp. Không biết có tồn tại hay không cách phân loại chất hữu cơ rành rẽ như phân loại trong sinh học, trong thực vật học, chia thành loài, họ, chi, ..., và có tồn tại một cách phân loại nhất quán cho cả cộng đồng hóa hữu cơ hay không ? (NMRHanoi vốn là "dân Vật lý" nên rất khó khăn khi đi tìm câu trả lời cho câu hỏi trên, mong được chia sẻ).

Theo nhiều tài liệu tiếng Việt thì các hợp chất hữu cơ được chia thành 3 nhóm chính là:

• Nhóm các hợp chất mạch vòng, ví dụ: Benzen, Napthelen, Toluene.
• Nhóm các hợp chất mạch không vòng, ví dụ: Metan, Axetylen, Isobutan.
• Nhóm các hợp chất mạch dị vòng, ví dụ: Pyridin, Furan, Quinolin.

Mỗi nhóm chất kể trên lại được chia nhỏ thành các cụm hay loại chất với thành phần nguyên tử và tính chất đặc trưng gọi là các nhóm chức, ví dụ: Phenol, Aldehyde, Ester.

Trong các tài liệu tiếng Việt còn có cách chia các hợp chất hữu cơ thành chỉ 02 nhóm chính là nhóm Hydrocarbon (các hợp chất chỉ chứa 2 loại nguyên tố là C và H) và nhóm dẫn xuất Hydrocarbon (là các Hydrocarbon mà trong đó có sự thế một hay nhiều nguyên tử H bằng các nguyên tử của các nguyên tố khác, như F, Cl, Br, P, ...).

NMRHanoi chưa rõ sự  khác nhau về ý nghĩa của 02 cách phân loại đã kể trên trong các tài liệu, giáo trình tiếng Việt. Có thể cách này là dưới góc độ người nghiên cứu cấu trúc, cách khác lại dưới góc độ người nghiên cứu hoạt tính, nghiên cứu lý thuyết, nghiên cứu liên kết hóa học hay nghiên cứu ứng dụng.

Theo nhiều tài liệu, giáo trình tiếng Anh về hóa hữu cơ thì việc phân loại có khác đôi chút, cụ thể vì các hợp chất dị vòng cũng chính là các hợp chất mạch vòng, trong đó có ít nhất một dị nguyên tử (nguyên tử khống phải C, thường là S, N hay O), do vậy có thể gộp các hợp chất dị vòng vào nhóm các hợp chất mạch vòng. Như vậy các hợp chất hữu cơ được chia thành 2 nhóm chính: Nhóm mạch vòng khép kín và nhóm mạch mở.

Phân loại các hợp chất hữu cơ theo mạch vòng và mạch không vòng

Dưới góc nhìn NMR thì việc phân các hợp chất hữu cơ thành 02 hay 03 nhóm không phải là quan trọng và ít có ảnh hưởng đến kết quả phân tích phổ. Điều mang ý nghĩa thực tiến nhiều hơn trong phân tích cấu trúc dựa trên dữ liệu phổ nói chung, phổ NMR nói riêng, chính là phân loại các nhóm chất theo đặc trưng cấu trúc và do đó là đặc trưng phổ đặc thù. Nói như vậy thì các nhóm chức chính là các nhóm chất có phổ đặc trưng. Nhiều tài liệu, giáo trình về NMR cũng xuất phát từ đặc trưng phổ của các nhóm chức.

Dạng phân chia phổ theo nhóm chức như nói ở trên rất tiện lợi, hữu ích và có tính sư phạm cao trong đào tao, cho các đối tượng mới làm quen với NMR. Trên thực tế, trong hóa học hữu cơ thì việc phân chia đến Nhóm chức như trên là quá đơn giản, ít ý nghĩa thực tiễn. Người ta thường phân chia các hợp chất hữu cơ thành các lớp hay họ chất (Class) phổ biến trong tự nhiên, thường có kích thước và cấu trúc lớn hơn, phức tạp hơn các nhóm chức, nhưng vẫn có các tính chất phổ đặc trưng. Cách phân chia này sẽ thiết thực hơn, ví dụ lớp terpen, lớp peptide, lớp flavonoid, ... Phần lớn các tài liệu tiếng Anh về ứng dụng NMR trong nghiên cứu đều dựa trên cách phân loại này. Vì vậy trong các nội dung tiếp theo dưới đây và một loạt trang tiếp theo (#8E đến #8K), việc phân tích đặc trưng phổ NMR sẽ dựa theo cách phân chia các hợp chất hữu cơ theo lớp chất như đã nói ở trên.

Lưu ý rằng, các lớp chất thực ra là sự ghép nối của các nhóm chức cơ bản. Mỗi lớp chất cũng có thể phân chia thành các phân lớp, như lớp terpen gồm các phân lớp hemiterpene, monoterpene, triterpenes, ... Ngược lại, các lớp chất cũng có thể ghép với nhau tạo thành các "siêu lớp". Nhiều hợp chất hữu cơ gặp trong thực tế là sự ghép nối hai hay nhiều lớp chất. Ví dụ như Quercetrin, một "siêu lớp chất" rất phổ biến trong tự nhiên, là một glycoside được tạo thành do ghép nối của một flavonoid (Quercetrin) với một gốc sugar rhamnose.

Một số lớp chất hữu cơ:

• Terpene:
• Flavonoid:
• Steroid:
• Saccharide:
• Peptide:

8.2.2. Chiến lược phân tích phổ NMR các lớp hóa hợp chất tự nhiên

Dưới đây là tổng hợp các quy tắc, lưu ý, nhận xét, kinh nghiệm về phân tích phổ NMR các lớp hóa hợp chất tự nhiên.

• Về thông tin liên quan tới mẫu chất: Cố gắng thu thập càng nhiều thông tin chính xác về mẫu càng tốt và khai tác triệt để các thông tin này. Với các mẫu tổng hợp thì thông tin thường khá đầy đủ, nhưng phải lưu ý các phản ứng phụ hoặc các phản ứng theo co chế làm sẽ làm cho các nhận xét về cấu trúc bị lệch hướng. Ngược lại, với các mẫu tách chiết từ thực vật thì thông tin sẽ nghèo hơn, ngoài thông tin về nguồn gốc thực vật. Thông tin về mức độ hòa tan mẫu trong các dung môi với mức độ phân cực khác nhau có thể giúp loại trừ một số lớp chất khỏi danh sách ứng cử. Dữ liệu phổ MS, phổ FTIR, phân tích thành phần nguyên tố đều có tác dụng hỗ trợ và rất hữu ích cho phân tích NMR.
• Về loại phổ NMR cần cho phân tích: Phổ 1D NMR tuy đơn giản, nhưng đôi khi chỉ cần đến 1D NMR đã có thể xác định được cấu trúc. Ví dụ với các lớp chất peptide, carbohydrate hay steroide nhiều khi chỉ cần phổ 1D NMR; Phổ 2D NMR thường chỉ cần đến với các lớp chất như alkaloid hay terpen. Với các phân tử vừa và lớn, nói chung không thể giải phổ trọn vẹn chỉ với phổ 1D (1H và 13C) mà không cần đến phổ 2D NMR. Nhưng  nên nhớ rằng phổ 1D NMR rất quan trọng. Chẳng hạn, phổ 13C giúp nhận ra ngay một số lớp chất, như terpen, và xác định được ngay tính đối xứng của phân tử; Một số thông số như số nối đôi,  nối ba, C=O, vòng thơm cũng rất dễ nhận biết trên phổ 13C NMR; Tỷ số Aliphatic/Aromatic xác định từ phổ 13C NMR cũng rất đặc trưng cho một số họ chất; Độ dịch chuyển hóa học của 13C cũng dễ tra cứu, độ lặp lại cao, ít chịu ảnh hưởng của pH, nhiệtđộ, dung môi. Trong khi đó, trên phổ 1H NMR có thể dễ dàng nhận biết nhiều nhóm chức, nhất là các nhóm OH và NH. Nếu nhỏ mấy giọt D2O vào mà làm mất đi một số tín hiệu thì có nghĩa đó là carbohydrate hoặc peptide.

• Về phổ 1D NMR: May mắn là sự khác biệt về độ dịch chuyển hóa học của proton thường cho phép chúng ta nhận biết nhiều họ chất ngay từ phổ 1H NMR. Mỗi họ chất thường có vùng phổ giá trị CS đặc trưng, dễ nhận biết trên phổ 1H NMR (xem hình dưới)

Giá trị CS đặc trưng của proton đối với một số lớp chất hữu cơ điển hình

Giá trị CS đặc trưng của 13C đối với một số lớp chất hữu cơ điển hình.

• Về phương pháp chuẩn bị mẫu: Biết mẫu chất được chiết bằng dung môi gì cũng là một thông tin quan trọng, vì khi làm sạch không tốt, dung môi sẽ còn lại một lượng nhỏ trong mẫu, khi đo phổ NMR sẽ nhầm là tín hiệu mẫu. Rất nhiều người đã rất chật vật và mất nhiều thời gian để gán một hay vài tín hiệu "lạc" mà không biết đấy chính là tín hiệu của vết dung môi chiết.